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Bereits vor 100 Jahren wurde das 1. Gesetz von Kohlrausch, (Gesetz der unabhängigen Ionenwanderung) formuliert:
Geladene Teilchen wandern in Lösung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes mit unterschiedlicher Geschwindigkeit.
In der ersten Hälfte des 20sten Jahrhunderts wurde dafür bereits der Begriff der "Elektrophorese" eingeführt. Unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeiten beruhen entweder auf den verschiedenen Ladungsdichten der Moleküle, die deshalb im angelegten elektrischen Feld verschieden stark beschleunigt werden oder auf unterschiedlichen Reibungswiderständen, die der Wanderung entgegenwirken.
Bei der klassischen Elektrophorese, eingeführt von Tiselius, verwendet man Gele oder Papierstreifen, die mit Elektrolytlösung imprägniert sind. Damit werden sowohl die Störungen durch Konvektion vermindert als auch für Makromoleküle mit geringen Differenzen in der Ladungsdichte die Wechselwirkung und damit die Trennleistung erhöht. Die klassische Gel- oder Papierelektrophorese hat aber zwei entscheidende Nachteile:
▪ Eine quantitative Analyse ist nur mit Remissionsmessungen möglich, wobei z. B. Proteine erst nach Anfärbung, und daher stark fehlerbehaftet, untersucht werden können.
▪ Um das Austrocknen des Gels zu verhindern, darf keine allzu große Spannung über dem Gelbett angelegt werden, da die Joulesche Wärme quadratisch mit der Spannung anwächst. Niedrige Spannungen führen aber zu langen Analysenzeiten, so dass für eine 10 cm lange Gelstrecke die Analysenzeit oftmals einige Stunden betragen kann.
Um die Detektions- und Kühlprobleme der klassischen Elektrophorese zu beheben, wurde versucht, die elektrophoretische Trennung auf offene Rohre, wie in der HPLC oder GC üblich, zu übertragen. Dabei traten jedoch neue Probleme durch Konvektionsströmungen im Elektrolyten auf. Die erste Trennung in einer offenen Glasröhre wurde 1967 von Hjertén beschrieben, der die thermische Stabilisierung der Lösung durch Rotation des Rohres um seine eigene Achse erreichte. Die eigentliche Entwicklung der Kapillarelektrophorese begann mit den Pionierarbeiten von Mikkers, Everearts und Verheggen gegen Ende der 70er Jahre. Dabei wurde der Erfolg durch den Einsatz dünner Kapillaren aus Glas und Teflon mit Innendurchmessern von 200 bis 500 µm erzielt. Die bekannten hocheffizienten Trennleistungen der CE konnten aber erst durch die von Jorgenson und Lukacs 1981 benutzten, aus der GC bekannten, fused-silica Kapillaren mit Innendurchmessern von 50 bis 200 µm erzielt werden. Das günstigere Oberflächen-Volumen-Verhältnis bei den Kapillaren verminderte den störenden Einfluss der thermisch induzierten Konvektion stark und Quarzkapillaren aus der GC ermöglichten es, HPLC-Detektoren zum direkten Nachweis der getrennten Substanzen in der Kapillare zu verwenden.
Der schematische Aufbau eines Kapillarelektrophorese-Systems ist in folgender Abbildung dargestellt:
Die Trennung findet in einer mit Puffer gefüllten Glaskapillare statt. Bei den meisten Applikationen verwendet man 30 bis 100 cm lange, mit Polyimid beschichtete, fused-silica Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 25 bis 100 µm. Nach der Probenaufgabe am Kapillarinlet tauchen beide Kapillarenden in die Puffergefäße ein. Zwischen den Kapillarenden wird dann eine Spannung bis zu 30000 V angelegt. Die Probenkomponenten migrieren im elektrischen Feld unterschiedlich schnell in Richtung Outlet und durchqueren dabei einen Detektor, mit dem eine qualitative und quantitative Auswertung erfolgen kann.
Die Trennung von Ionen in einem elektrophoretischen System beruht auf den unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten. Die Geschwindigkeit der Ionen ist abhängig von ihrer Geometrie und der Ladung. Außerdem hängt sie von der Temperatur, dem pH-Wert, der Viskosität des Trennmediums und der elektrischen Feldstärke ab. Substanzen, die in einer Elektrolytlösung als Ionen vorliegen, sind im elektrischen Feld verschiedenen Kräften ausgesetzt (Abbildung 1):
Einfluss der Beschleunigungs- und Reibungskraft auf ein geladenes Teilchen
Fep: Beschleunigungskraft; FR: Reibungskraft; E: Feldstärke; zi: Ladungszahl des Teilchens; eo: elektrische Elementarladung; vep: elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit
Die Beschleunigungskraft Fep berechnet sich nach folgender Gleichung:
Gleichung 1:
Die auf die bewegten Teilchen ausgeübte Reibungskraft FR kann unter der Annahme von kugelförmigen Ionen in einem laminaren Fluss näherungsweise durch das Stokesche Gesetz beschrieben werden:
Gleichung 2:
η: Viskosität; ri: Stokescher Radius des Ions
Das Ion wird solange beschleunigt, bis es zu einem Kräftegleichgewicht zwischen der Beschleunigungskraft Fep und der Reibungskraft FR kommt.
Gleichung 3:
Im Kräftegleichgewicht bewegen sich alle Ionen mit einer konstanten Geschwindigkeit vep, welche direkt proportional zum angelegten elektrischen Feld ist:
Gleichung 4:
µep: elektrophoretische Mobilität
Die elektrophoretische Mobilität µep [m2/Vs] stellt für eine ionische Spezies eine Konstante dar und repräsentiert die Wanderungsgeschwindigkeit bei einer angelegten Feldstärke von 1 V/m. Die Werte der elektrophoretischen Mobilitäten unterschiedlicher Ionen unter Standardbedingungen sind tabelliert. Die elektrophoretischen Mobilitäten der Kationen erhalten ein positives, die der Anionen ein negatives Vorzeichen.
Durch Einsetzen von Fep und FR in Gleichung 3 und Berücksichtigung von Gleichung 4 erhält man:
Gleichung 5:
Daraus ergibt sich für die elektrophoretische Mobilität µep:
Gleichung 6:
Die direkte Berechnung der elektrophoretischen Mobilität ist aufgrund der molekül- und pufferspezifischen Größen nicht möglich, da Gleichung 6 nur für sphärische Teilchen in unendlich verdünnten Lösungen gilt. Des Weiteren ist der Stokesche Radius meist nicht bekannt und mit dem messbaren Ionenradius in Kristallgittern nicht korreliert. In einer realen Elektrolytlösung endlicher Ionenkonzentration baut sich um ein Ion eine Wolke aus Gegenionen auf, welche die effektive Ladung des Ions verringert. Deshalb migriert das Ion langsamer als es seiner Ladung entspricht. Dies nennt man den elektrophoretischen Effekt. Eine weitere Konsequenz ist der Relaxationseffekt, der aus dem stetigen Auf- und Abbau der Gegenionenwolke im elektrischen Feld resultiert. Die Ionenwolke deformiert sich dabei, so dass die Zentren der positiven und negativen Ladungen nicht mehr zusammenfallen und dadurch die Bewegung des Zentralions ebenfalls gebremst wird.
Ein zweiter für die Trennung in der CE wichtiger elektrokinetischer Effekt ist die Elektroosmose. Darunter versteht man die Bewegung einer Elektrolytlösung relativ zu einer geladenen Oberfläche durch ein angelegtes elektrisches Feld. Im Prinzip basiert das Phänomen der Elektroosmose auf ein von Helmholtz und Stern beschriebenes Zwei-Phasen-System, dass aus einer stationären festen Phase (fused-silica Kapillare) und einer beweglichen flüssigen Phase (Elektrolyt) besteht. Zwischen beiden bildet sich aufgrund des angelegten elektrischen Feldes eine elektrische Doppelschicht aus.
Die am häufigsten verwendeten Kapillaren bei der CE sind die aus der GC bekannten fused-silica Kapillaren, an deren Oberfläche Silanolgruppen vorliegen. Diese Silanolgruppen mit einem pKSiOH < 2 sind je nach pH-Wert der Elektrolytlösung mehr oder weniger stark dissoziiert.
Wegen des niedrigen pK-Wertes werden fused-silica Kapillaren, die mit einer Elektrolytlösung gefüllt sind, als negativ geladene Oberfläche betrachtet. Die dissoziierten Silanolgruppen stellen den stationären negativen Teil der elektrischen Doppelschicht dar, an dem Kationen adsorbiert und Anionen abgestoßen werden. Ein Teil dieser Kationen wird durch die elektrostatische Anziehungskraft in der Nähe der Kapillarwand fixiert. Diese starre Grenzschicht mit adsorbierten Kationen wird auch als "Sternschicht" bezeichnet. Um die verbleibenden negativen Ladungen an der Kapillaroberfläche auszugleichen, werden weitere Gegenionen angelagert. Bedingt durch ihre Hydrathülle können nicht alle Kationen an der Oberfläche fixiert werden. Es entsteht eine diffuse Grenzschicht, die sogenannte "Gouy-Chapman-Schicht", deren Kationenkonzentration exponentiell mit dem Abstand von der fused-silica Oberfläche abnimmt.
Mit größer werdender Entfernung zwischen negativer Kapillarwand und Kationen der "Gouy-Chapman-Schicht" verringert sich die Coulombsche Wechselwirkung und ermöglicht die Wanderung der diffusen Grenzschicht zum negativ geladenen Pol. Dabei gleitet die "Gouy-Chapman-Schicht" über die an der Kapillarwand fixierte erste Schicht, was zu einer Scherfläche zwischen den Schichten führt. In Abbildung 2 (oben) ist der Aufbau der elektrischen Doppelschicht schematisch dargestellt. Abbildung 2 (unten) skizziert den Potentialverlauf in Abhängigkeit vom Abstand der Kationen zur negativen Kapillaroberfläche. Die starre Sternschicht, in der das Potential mit zunehmender Entfernung zur Kapillarwand linear abnimmt, ist im Gleichgewicht mit der diffusen Grenzschicht, in der das Potential exponentiell auf 0 zurückgeht. Die Elektroosmose ist von dem Potential an der Scherfläche zwischen starrer und beweglicher Schicht abhängig. Dieses zeta-Potential ist eine experimentell indirekt zugängliche Größe.
Legt man in einer mit Elektrolyt gefüllten Kapillare, parallel zur geladenen Oberfläche, ein elektrisches Feld an, so zieht das Feld die Kationen in der "Gouy-Chapman-Schicht" längs seiner Achse an und bewegt infolge der inneren Reibung die gesamte Flüssigkeit in der Kapillare mit. Im Falle von fused-silica Kapillaren mit einer Anreicherung von positiven Ionen in der Grenzschicht, ist der elektro-osmotische Fluss (EOF) zur Kathode gerichtet.
Es bildet sich ein extrem flaches, stempelförmiges Strömungsprofil aus, welches zu einer sehr geringen Dispersion der Probenzonen und daher zu schmalen Peaks und hohen Effizienzen führt. Im idealisierten Fall sollte bei der Kapillarelektrophorese nur die Axialdiffusion zur Bandenverbreiterung beitragen. Dieser Beitrag kann mit dem Einstein-Smoluchowskischen Gesetz der Diffusion bestimmt werden:
Gleichung 7
D: Diffusionskoeffizient
des Analyten; tm: Migrationszeit;
σ2: Bandenverbreiterung durch
Diffusion
Im Vergleich dazu kommt es bei der druckgetriebenen Strömung in der Chromatographie zur Ausbildung eines parabolischen Hagen-Poisseuilleschen-Strömungsprofils, welches zu einer deutlich stärkeren Dispersion der Probenzonen und damit zu breiteren Peaks und Effizienzverlusten führt (Abb. 3).
Um zu zeigen, wie der EOF eines kapillarelektrophoretischen Systems beeinflusst werden kann, ist es notwendig, das zeta-Potential mathematisch zu beschreiben. Man geht dazu vom Modell des parallelen Plattenkondensators aus, welcher für die Beschreibung von Doppelschichten zwischen zwei sich relativ zueinander bewegenden Phasen geeignet ist:
Gleichung 8:
ζ: Zeta-Potential; ω:
Ladungsdichte an der Wandoberfläche
P: Debye-Hückel Parameter; ε: Dielektrizitätskonstante des Elektrolyten
Der Debye-Hückel Parameter P wird durch folgende Gleichung definiert:
Gleichung 9:
F: Faraday Konstante; R:
Gaskonstante; ε0: Dielektrizitätskonstante des Vakuums;
u: Ionenstärke; T: Temperatur
Die Ionenstärke u ist definiert als:
Gleichung 10:
ci: Konzentration aller Pufferbestandteile; zi: Ladungszahl der Ionen
Aus den Gleichungen 8 bis 10 ist ersichtlich, dass das zeta-Potential und damit auch der EOF sich umgekehrt proportional zur Ionenstärke des Elektrolyten und direkt proportional zur Ladungsdichte an der Kapillarwand verhalten. Eine Konzentrationserhöhung des Puffers bewirkt somit eine Verringerung, eine Steigerung des pH-Wertes eine Erhöhung des elektroosmotischen Flusses.
Die Smoluchowski-Gleichung beschreibt den Zusammenhang zwischen der Geschwindigkeit der Volumenströmung innerhalb der Kapillare, der Feldstärke und dem zeta-Potential:
Gleichung 11:
veof: Geschwindigkeit der Volumenströmung (Elektroosmotischer Fluss)
Daraus ergibt sich für die elektroosmotische Mobilität µEOF:
Gleichung 12:
Ein kathodischer elektroosmotischer Fluss übt eine Kraft in Richtung Kathode auf die Analytmoleküle aus, so dass sich die effektive Mobilität eines Ions aus der vektoriellen Summe der elektrophoretischen Mobilität des Ions und der elektro-osmotischen Mobilität im jeweiligen System ergibt:
Gleichung 13:
µeff: effektive Mobilität; µeof:
elektroosmotische Mobilität;
µep: elektrophoretische Mobilität
Durch Ausnutzung des elektroosmotischen Flusses ist es möglich, Kationen, Anionen und ungeladene Moleküle gemeinsam zur Kathode zu bewegen. Dazu muss gewährleistet sein, dass µep (Anion)< µeof ist, so dass der EOF die entgegengerichtete elektrophoretische Migration der Anionen überkompensiert. Die Kationen werden dann, gefolgt von den ungeladenen Molekülen, vor den Anionen die Kathode erreichen.
Durch das anliegende elektrische Feld wird in der Kapillare ein Stromfluss erzeugt, der unter anderem vom Kapillardurchmesser und von der spezifischen Leitfähigkeit des Puffers abhängt:
Gleichung 14:
I: Stromstärke; U: Spannung;
κ: Elektrolytleitfähigkeit;
d: Kapillarinnendurchmesser; Lges: Gesamtlänge der Kapillare
Gleichung 15:
P: Leistung
Gleichung 15 zeigt die quadratische Abhängigkeit der elektrischen Leistung von der Spannung und vom Kapillardurchmesser. Wegen der teilweisen Umwandlung der elektrischen Leistung in Joulesche Wärme muss bei einer Verdopplung des Innendurchmessers der Kapillare die Spannung geviertelt werden, damit die Leistung und somit die Joulesche Erwärmung konstant bleiben. Eine Reduzierung der Spannung hat aber eine Verlängerung der Analysenzeiten zur Folge. Darüber hinaus bedingt der Einsatz von Kapillaren mit großen Innendurchmessern eine Erhöhung der Bandenverbreiterung durch die Probendiffusion. Der Abtransport der durch die elektrische Leistung verursachten Jouleschen Wärme erfolgt ausschließlich über die Kapillarwand. Dabei bildet sich ein radialer, parabolischer Temperaturgradient im Puffer senkrecht zur elektrophoretischen Wanderung aus, mit einer bis zu 10 °C höheren Temperatur in der Kapillarmitte gegenüber der inneren Kapillarwand. Durch diesen Temperaturgradienten wird ein Viskositätsgradient im Puffer erzeugt. Da die Analytmoleküle in Bereichen mit hoher Pufferviskosität (Kapillarwand) langsamer wandern als in Bereichen mit geringerer Viskosität (Kapillarmitte), kommt es zu Bandenverbreiterungen. Die Verwendung von Kapillaren mit kleineren Innendurchmessern und von Puffern mit geringerer Ionenleitfähigkeit führt, genauso wie die Herabsetzung der Pufferkonzentration, zu einer Verringerung der Jouleschen Wärme.
An das Aufgabensystem in der Kapillarelektrophorese wird eine hohe Anforderung gestellt, da die benötigten Injektionsvolumina nur einige nl betragen. Generell wird entweder die hydrodynamische oder elektrokinetische Injektion eingesetzt.
Die hydrodynamische Injektion kann durch das Anlegen eines Druckes am Inlet, eines Vakuums am Outlet oder eines hydrostatischen Druckes erfolgen. Am häufigsten wird die Probe durch Anlegen einer Druckdifferenz zwischen Probengefäß und Kapillarende aufgegeben, wobei der Druck am Probengefäß erhöht wird. Die aufgegebene Probenmenge berechnet sich nach dem Poisseuilleschen Gesetz für laminare Flüsse in einem Rohr:
Gleichung 16:
Vi:
Injektionsvolumen; Δp: Druckdifferenz; r: Innenradius der Kapillare;
tInj: Injektionszeit
Der schnelle Anstieg und Abfall des Druckes über dem Probengefäß führt zu Druckspitzen, die ein reproduzierbares Injektionsvolumen ausschließen. Deshalb benutzt man in der Praxis bei einem langsamen Anstieg und Abfall des Druckes ein Druck-Injektionszeit-Produkt (Abb. 4), welches ein reproduzierbares Injektionsvolumen gewährleistet.
Bei der Injektion durch Anlegen eines hydrostatischen Druckes (Einfluss der Gravitation) wird das Probengefäß mit dem Kapillarinlet auf eine definierte Höhe angehoben. Die Druckdifferenz berechnet sich nach Gleichung 17:
Gleichung 17:
ρ: Dichte der Probenlösung; g: Erdbeschleunigung; Δh: Höhendifferenz zwischen dem Flüssigkeitsspiegel der Probe (Inlet) und des Puffers (Outlet)
Abb. 4. Druck-Injektionszeitprodukt bei der hydrodynamischen Injektion
Bei der elektrokinetischen Injektion nutzt man die Tatsache aus, dass das elektrische Feld in der Kapillare eine elektrophoretische und eine elektroosmotische Bewegung erzeugt. Wenn das Kapillarinlet in ein Probengefäß eintaucht und für einige Sekunden eine Spannung angelegt wird, migrieren die geladenen Probenkomponenten in die Kapillare. Die Konzentration der injizierten Probenbestandteile i berechnet sich nach folgender Gleichung:
Gleichung 18:
Qi: Konzentration der injizierten Spezies i; ci: Konzentration der Spezies i im Probengefäß
Die Konzentrationen der injizierten Probenkomponenten können durch die Injektionszeit oder die angelegte Spannung variiert werden. Sie sind vom elektroosmotischen Fluss in der Kapillare und von der elektrophoretischen Mobilität der jeweiligen Probenkomponenten abhängig. Dies führt zu einer Ionendiskriminierung, wenn sich die elektrophoretischen Mobilitäten der verschiedenen Spezies stark unterscheiden. Ein weiterer Nachteil liegt in der Verdünnung des Probenreservoirs hinsichtlich der Ionen mit einer hohen Mobilität, was bei Mehrfachmessungen nicht vernachlässigt werden darf. Auch spielt die elektrische Leitfähigkeit der Probenlösung eine sehr wichtige Rolle, da sich der EOF und die elektrophoretische Migrationsgeschwindigkeit mit der Probenleitfähigkeit ändern. Diesen Nachteilen der elektrokinetischen Injektion steht als Vorteil nur die Probenanreicherung im Injektionspfropfen gegenüber, die bei einer hydrodynamischen Injektionsmethode durch "Electrostacking" ebenfalls erreicht werden kann.
In der Kapillarelektrophorese unterscheidet man zwischen On-column- und Post-column-Detektoren:
Um Effizienzverluste durch Vermischungseffekte außerhalb der Kapillare zu vermeiden, erfolgt die Detektion mit Hilfe direkter und indirekter UV/VIS- und Fluoreszenzmethoden in der Kapillare. Wegen der geringen Schichtdicke (Innendurchmesser der Kapillare 25 bis 100 µm) müssen an die Detektoren hohe Anforderungen bezüglich Empfindlichkeit, Rauschen, Streulichteinfluss etc. gestellt werden. Bei der Fluoreszenzdetektion kann der Nachteil der geringen Schichtdicke teilweise durch den Einsatz von Lasern als Lichtquelle ausgeglichen werden.
Bei diesen Detektoren werden die Probenkomponenten erst am Kapillarende detektiert. Zurzeit käuflich zu erwerbende Post-column-Detektoren sind Leitfähigkeitsdetektoren und massenselektive Detektoren.
Des Weiteren werden in der Literatur einige Detektionsarten, wie beispielsweise die Raman-Spektroskopie, die On-line-Radioaktivitätsmessung, die gepulste Amperiometrie, die Circulardichroismus- und die Brechungsindexbestimmung beschrieben.
Die von der Chromatographie bekannten Größen zur Beschreibung der Selektivität, der theoretischen Bodenhöhe H und der Bodenzahl N wurden von Jorgenson und Lukacs auf die Kapillarelektrophorese übertragen, so dass ein Elektropherogramm nach den gleichen Kriterien wie ein Chromatogramm ausgewertet werden kann. Dabei ist allerdings zu beachten, dass die Signale im Elektropherogramm nur selten in Form einer Gaußschen Glockenkurve vorliegen, sondern in der Regel die Form eines Dreiecks annehmen, weswegen die Übertragung der chromatographischen Parameter auf die Elektrophorese nur eine mathematische Näherung darstellt.
In Analogie zur Retentionszeit wird die Migrationszeit als die Zeit bezeichnet, die eine Komponente von der Probenaufgabe bis zum Detektor benötigt:
Gleichung 19:
tm: Migrationszeit;
Leff: Länge der Kapillare bis zum Detektor;
veff: Wanderungsgeschwindigkeit der Probenkomponente
Die Wanderungsgeschwindigkeit veff der Probenkomponente setzt sich aus der vektoriellen Summe der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit und des elektroosmotischen Flusses zusammen:
Gleichung 20:
veof:
Geschwindigkeit des elektroosmotischen Flusses;
vep: elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit
Nach Einsetzen in Gleichung 19 erhält man für die Migrationszeit tm folgende Beziehung:
Gleichung 21:
In der Chromatographie wird als Maß für die Selektivität der Selektivitätsfaktor a herangezogen, welcher als Quotient der Kapazitätsfaktoren ki der beiden zu trennenden Analyten definiert ist:
Gleichung 22:
wobei t2 = t1
k1,2:
Kapazitätsfaktoren der Analyten 1 und 2; t1,2: Retentionszeiten der
Analyten;
t0: Totzeit
Unter Berücksichtigung, dass es in der Kapillarzonenelektrophorese (CZE) keine Totzeit t0 gibt und dass die Trennung nur auf die verschiedenen elektrophoretischen Mobilitäten der Analyten und nicht auf die Unterschiede in den Verteilungsgleichgewichten zweier Phasen zurückzuführen ist, gilt für den Selektivitätsfaktor a analog Gleichung 22:
Gleichung 23:
αCE:
Selektivitätsfaktor in der CE;
tm1,2: Migrationszeiten der Analyten 1 und 2
Als ein quantitatives Maß für die Effizienz eines elektrophoretischen Systems können in Analogie zur Chromatographie die theoretische Bodenhöhe H und die Anzahl der theoretischen Böden, auch Trennstufenzahl N genannt, verwendet werden. Beide Größen sind durch folgende Gleichung miteinander verknüpft:
Gleichung 24:
Die Breite eines Peaks lässt sich durch seine Standardabweichung s (in Längeneinheiten) oder Varianz σ2 darstellen. Wie bei der Chromatographie ist H als die auf die effektive Kapillarlänge bezogene Varianz definiert:
Gleichung 25:
σ2: Varianz des Konzentrationsprofils bei der Gaußschen Normalverteilung
Zur Umrechnung in Zeiteinheiten dient Gleichung 26, in der σ und t (Standardabweichung der Peaks in Zeiteinheiten) miteinander verknüpft sind:
Gleichung 26:
mit t ungefähr W/4 folgt aus Gleichung 26:
Gleichung 27:
W: Basispeakbreite
Durch Einsetzen von Gleichung 27 in Gleichung 25 erhält man:
Gleichung 28:
Mit Gleichung 24 ergibt sich die theoretische Bodenzahl N zu:
Gleichung 29:
Unter Verwendung der Halbwertsbreite W0.5 (Breite des Peaks auf halber Höhe) erhält man:
Gleichung 30:
Für die quantitative Beschreibung der Trennung zweier Analyten wird die Auflösung R verwendet, die bei der Betrachtung symmetrischer Peaks mit Gauß-Form folgendermaßen definiert ist:
Gleichung 31:
W1,2: Basispeakbreite der Analyten 1 und 2
Aus Gleichung 31 lässt sich mit Hilfe der Grundgröße k, a und N die neue Fundamentalgleichung 32 gewinnen, die den Zusammenhang dieser Größen mit der Auflösung quantitativ darstellt:
Gleichung 32:
Das Fehlen einer stationären Phase bei der Kapillarzonenelektrophorese bedeutet, dass der Retardationsterm, der auf die unterschiedlichen Aufenthaltszeiten der Analyten in der stationären Phase zurückzuführen ist, wegfällt. Bezugnehmend auf die Formel für die Auflösung in der Chromatographie, beschreibt Gleichung 33 die in der Kapillarzonenelektrophorese relevante Formel für die Auflösung:
Gleichung 33:
Während der Trennung unterliegen die migrierenden Zonen einer Bandenverbreiterung, die durch Diffusion, thermische Konvektion, Adsorptionseffekte an der Kapillarwand etc. hervorgerufen wird. Im Idealfall kann, wie schon erwähnt, das resultierende Konzentrationsprofil der jeweiligen Zone, ebenso wie in der Chromatographie, durch eine Gaußverteilung beschrieben werden, wobei die Gesamtvarianz s2 als Summe der individuellen Varianzen aufgeführt wird:
Gleichung 34:
Die einzelnen Terme beschreiben die Einflüsse der Injektion, Diffusion, Jouleschen Wärme, Elektromigration, Elektroosmose, Adsorption und anderer Effekte, die alle berücksichtigt werden müssen, um eine erfolgreiche Analyse mit der Kapillarelektrophorese zu gewährleisten.
Die Wahl des als Elektrolytlösung verwendeten Puffersystems hat den größten Einfluss auf die Trennleistung und sollte deshalb sehr sorgfältig vorgenommen werden. Folgende Forderungen muss ein Puffersystem in der Kapillarzonenelektrophorese erfüllen:
▪ Selektivität für die zu trennenden Ionen
▪ Stabilität des Puffers, stabiler pH-Wert durch hohe Pufferkapazität
▪ geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlänge
▪ das Gegenion sollte eine geringe Mobilität besitzen
▪ Anpassung der Mobilität zwischen Analyt- und Pufferionen
Die Pufferkonzentration sollte so gewählt werden, dass der pH-Wert durch die einsetzende Elektrolyse annähernd konstant bleibt, der EOF noch groß genug ist, um schnelle Analysenzeiten zu gewährleisten und noch keine Bandenverbreiterung durch thermische Effekte eintreten kann. Ob eine Dispersion durch thermische Effekte vorliegt, kann dadurch bestimmt werden, dass bei steigenden Feldstärken die resultierenden Stromstärken im Puffer bestimmt und gegen die Spannung aufgetragen werden. Gemäß dem Ohmschen Gesetz besteht ein lineares Verhältnis zwischen der Spannung und der Stromstärke. In der Kapillare steigt die Leitfähigkeit des Puffers mit der Temperatur an. Wenn die Kühlung nicht mehr ausreicht, um die Joulesche Wärme abzuführen, nimmt der Strom überproportional mit der angelegten Spannung zu und der Gültigkeitsbereich des Ohmschen Gesetzes wird verlassen. Solange mit Pufferkonzentrationen und Spannungen gearbeitet wird, die in diesem Gültigkeitsbereich liegen, kann die Bandenverbreiterung durch thermische Effekte vernachlässigt werden. Wird der lineare Bereich aber verlassen, muss entweder die Pufferkonzentration, die Spannung oder der Kapillarinnendurchmesser verringert werden.
Effizienzverluste treten ebenfalls auf, wenn große Unterschiede in der Leitfähigkeit zwischen Analyt und Puffer bestehen. Diese lokalen Störungen des elektrischen Feldes führen zu einer Verzerrung der Zonen und damit zu frontenden (lS>lB) oder tailenden (lS<lB) Peaks (mit lS als Leitfähigkeit des Analyten und lB als Leitfähigkeit des Puffers). Nur wenn die Leitfähigkeit in der Analytzone mit dem des Puffers identisch ist, werden relativ symmetrische Signale erhalten.
Der Einfluss des pH-Wertes beim Transport der Analyten zum Detektor kann auf zwei Ursachen zurückgeführt werden. Wie bereits beschrieben, ist die elektrophoretische Migration meistens durch den elektroosmotischen Fluss überlagert, dessen Größe unter anderem durch die Dissoziation der Silanolgruppen der Kapillarwand beeinflusst wird. Darüber hinaus ist die Beweglichkeit der Analytmoleküle von ihrem Dissoziationsgrad im Elektrolyten, und damit von seinem pH-Wert abhängig. Deshalb kann durch die Veränderung des pH und der Art des Puffers die Trennung optimiert werden. Erst bei pH-Werten unter 2 und über 12 übernehmen überwiegend die Protonen bzw. Hydroxidionen den Stromtransport. Durch die extrem hohe Mobilität dieser Ionen wird eine große Stromstärke und dadurch auch eine hohe Joulesche Wärme erzeugt, die sich nachteilig auf die Trenneffizienz auswirkt.
Ich möchte an dieser Stelle nur Lehrbücher empfehlen:
H. Engelhardt, W. Beck und T. Schmitt in "Kapillarelektrophorese: Methoden und Möglichkeiten", Vieweg-Verlag, Braunschweig/Wiesbaden (1994)
Anmerkung: Dieses Lehrbuch empfehle ich immer Studenten und Diplomanden/Doktoranden, die sich in das Gebiet der CE einarbeiten möchten. Es ist hervorragend und leicht verständlich geschrieben und auch in englischer Sprache erhältlich.
R. Kuhn und S. Hoffstetter-Kuhn in "Capillary Electrophoresis:; Principles and Practice", Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York (1993)
Anmerkung: Dieses Lehrbuch empfehle ich immer zur weiteren Vertiefung. Die Theorie wird ausführlich behandelt und als ein besonderes Plus sehe ich die tabellarische Auflistung verschiedener Applikationsbeispiele mit der dazu gehörenden Literatur an.
F. Foret, L. Krivankova und P. Bocek in "Capillary Zone Electrophoresis", VCH, Weinheim, New York (1993)
Anmerkung: Ein hervorragendes Buch über die Theorie der Kapillarelektrophorese. Dieses Buch ist für den Wissenschaftler, der einen tiefen Einblick in die CE gewinnen möchte, sehr empfehlenswert.
M. G. Khaledi (Editor) in "High-PErformance Capillary Electrophoresis: Theorie, Techniques, and Applications", Wiley & Sons, New York, Chichester, Weinheim (1998)
Anmerkung: Dieses Buch eignet sich hervorragend für den Praktiker. Es beschreibt beinahe alle Spielarten der CE und spart nicht mit Literaturhinweisen. So kann der CE-erfahrene Leser sich schnell in neue CE-Methoden einarbeiten.
A. S. Rathore and A. Guttman in "Electrokinetic Phenomena: Principles and Applications in Analytical Chemistry and Microchip Technology", Marcel Dekker, Inc. New York, Basel (2004)
Anmerkung: Den Editoren A. S. Rathore und A. Guttman ist es mit dem Buch "Electrokinetic Phenomen: Principles and Applications in Analytical Chemistry and Microchip Technology" gelungen, für jedes Kapitel absolute Fachleute als Autoren zu gewinnen. Dadurch wird eine gleich bleibend hohe Qualität der einzelnen Kapitel gewährleistet, die alle sehr verständlich geschrieben wurden.
In dem vorliegenden Buch wird das schnell fortschreitende theoretische Wissen in den unterschiedlichen Spielarten der Kapillarelektrophorese (CZE, MEKC; CGE, cIEF, ACE, CEC, µ-CE) in kompakter, gut lesbarer und kompetenter Form dargestellt. Das Buch ist für den erfahrenen CE-User sehr empfehlenswert. Für den Einsteiger gibt es sicher besser geeignete Lehrbücher auf dem Markt.
Nach einer ungewöhnlichen, jedoch durchaus gelungenen Einführung, bei der die Trennmechanismen der CZE mit denen der HPLC und CEC verglichen werden, verrät mit Robert Weinberger ein absoluter CE-Fachmann seine analytischen Tricks und gibt sehr nützliche praktische Tipps, die auch noch den erfahrenen CE-User interessieren dürften. Im Anschluss werden verschiedene Techniken (cIEF, CGE und ACE), von denen vor allem die cIEF und die ACE in vielen CE-Lehrbüchern meist etwas zu kurz kommen, ausführlich und kompetent beschrieben. Es folgen vier Kapitel über verschiedene Aspekte der CEC, die kaum Fragen offen lassen. So werden in Kapitel 6 neben vertiefenden theoretischen Überlegungen auch Einflüsse verschiedener Parameter auf die Trennleistung anschaulich behandelt. Besonders die theoretische Beschreibung des elektroosmotischen Flusses bei der CEC ist sehr gut gelungen und wurde bisher noch in keinem mir bekannten Lehrbuch so ausführlich dargestellt. Das folgende Kapitel behandelt eher praktische Aspekte der CEC, wie beispielsweise unterschiedliche Packungsarten oder verschiedene Möglichkeiten der Frittenbildungen, wobei sogar der recht exotische Keystone-Effekt exzellent beschrieben wurde. Kapitel 8 behandelt den Einfluss eines geringen EOFs auf die Trennleistung, weshalb es inhaltlich besser als Kapitel 7 im Buch positioniert worden wäre. Eine weitere Bereicherung stellt das leider sehr kurz gehaltene Kapitel über ultrashort-column CEC dar. Eine Einführung in die innovative und faszinierende Welt der Micro-CE wird dann in drei sehr interessanten Kapiteln unter zu Hilfenahme von vielen anschaulichen schematischen Darstellungen gegeben. So werden die meisten literaturbekannten Highlights dieser noch jungen Technik mit vorzüglichem Bildmaterial ausführlich beschrieben. Auch wenn die noch sehr forschungsintensive Kopplung der CE und CEC mit der NMR, die von namhaften Autoren hervorragend in Kapitel 13 beschrieben wurde, thematisch weniger in dieses Buch hineinpasst, so ist dieses Kapitel trotzdem lesenswert. Auf den abschließenden 125 Seiten werden in zwei Kapiteln verschiedenste Applikationen aus den Gebieten der CEC und Micro-CE ausführlich dargestellt und stellen eine enorme Hilfe dar, um ein gegebenes analytisches Trennproblem mit der Kapillarelektrophorese zu lösen. Besonders hervorzuheben ist hierbei die sehr übersichtliche tabellarische Darstellung der CEC-Applikationen nach stationären Phasen, bei denen selbst molecularly imprinted polymers nicht vergessen wurden. Am Ende jedes Kapitels sind für ein Buch äußerst aktuelle Literaturstellen aufgelistet, die es dem Leser ermöglichen, sich den aktuellen Wissenstand schnell anzueignen.
Dieses Buch kann ich uneingeschränkt all denen empfehlen, die sich bereits seit einiger Zeit mit der Kapillarelektrophorese beschäftigen.